Gráfica nº 4: efecto de la presencia y ausencia del inhibidor fosfato en la velocidad de reacción de la fosfatasa alcalina. 1/v vs 1/ [s].
Ki = 42mM
Cálculos
Calcular los dobles inversos 1/V y 1/(s)
1. Efecto de la Inhibición del Fosfato Inorgánico sobre la Actividad Enzimática
– Hallar las concentraciones de sustrato.
-A partir de la absorbancia obtenida, calcular las concentraciones de producto.
– Conversión de las concentraciones de mM a micromoles. Hallar la velocidad de reacción.
– Calcular los dobles inversos 1/V y 1/(s)
– Calcular Ki para el fosfato inorgánico.
Análisis de Resultados
- El inhibidor utilizado es no competitivo.
- La reacción observada presenta propiedades de una cinética de reacción de orden uno ya que está aumentando la concentración de producto obtenido, directamente proporcional a la concentración de sustrato.
- Para alcanzar la velocidad máxima de reacción debemos suministrar cantidades de sustrato mayores a las utilizadas ya que no se alcanza con ninguna de estas.
- El km obtenido fue muy alto esto significa que necesitamos una gran cantidad de sustrato para alcanzar la velocidad máxima, lo que indica que la afinidad entre el complejo enzima sustrato es débil.
- La absorbancia aumento directamente proporcional con la concentración del sustrato.
- No se alcanza a obtener una concentración del producto igual al estándar debido a imprecisiones en la medición de volumen.
- La concentración del producto bajo el efecto del inhibidor es muy baja.
- El inhibidor influye directamente en la velocidad de la reacción.
- Las rectas se cortan en el eje X del segundo cuadrante.
- Solo teníamos una pipeta de 1 ml. Lo que influye en el margen de error.
- Observando el comportamiento de la fosfatasa en el laboratorio, en el que la coloración amarilla, producto de la catálisis (hidrolización del éster fosfórico), se hacía más intensa la coloración por el hecho de un aumento en la formación de producto, lo cual quiere decir que a medida que se incrementa la concentración de sustrato se incrementa la formación de producto.
- Las velocidades iniciales en presencia del inhibidor, como efecto de éste disminuye por motivos que anteriormente se mencionaron. La diferencia entre las velocidades en presencia del inhibidor se hace cada vez menor con respecto a una reacción cinética sin él. En pocas palabras, la velocidad se incrementa en cantidades discretas en tanto más sustrato se adicione. No es posible mediante nuestros resultados gráficos determinar en qué concentración de sustrato, esta velocidad llega a hacerse constante, máxima, como resultado de la saturación de la enzima.
- Gran parte de los errores obtenidos al hallar el Km se debieron a que el fotocolorímetro, presentaba fallas que no permitían hallar bien la absorbancia, ya que el dial ondulaba demasiado.
Conclusiones
- El estudio cinético de la enzima fosfatasa alcalina es de gran importancia desde el punto de vista médico, pues permite el diagnóstico de enfermedades.
- El método utilizado durante este laboratorio para analizar la actividad catalítica de la enzima es sencillo y económico, además que demuestra su efectividad.
- Conocer la actividad de un determinado inhibidor es de gran importancia, tanto desde el punto de vista biológico como médico.
Bibliografía
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- DEVLIN, Thomas. Bioquímica: libro de texto con aplicaciones clínicas, Tomo 1, Segunda Edición. Bogotá, Reverté S.A., 1993.
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