Parámetros Cinéticos de la Fosfatasa Alcalina

La fosfatasa alcalina es una hidrolasa con muy poca especificidad de sustrato. Se encuentra presente en casi todos los tejidos del cuerpo, especialmente, en epitelio intestinal, túbulos renales, hueso, hígado y placenta. Su localización celular es la membrana. Los individuos de los grupos sanguíneos B o O secretores tienen la isoenzima intestinal en sus sueros.

Marco Teórico 

• Enzima: Las células vivas obtienen la energía y los componentes necesarios para su supervivencia de un gran número de reacciones químicas que transcurres de forma constante y ordenara, y en condiciones relativamente constantes (ph=7, T=37°C). En estas condiciones suaves, muchas de ellas no transcurrirían a una velocidad apreciable, para acelerar la velocidad de estos procesos metabólicos, las células poseen catalizadores específicos denominados enzimas. Dichas enzimas son de naturaleza proteica y se caracterizan por poseer una elevada eficacia catalítica, además de que pueden recuperar su estado inicial, como todo catalizador, después de cada ciclo catalítico. 
• Catálisis Enzimática: Como cualquier catalizador, las enzimas aceleran las reacciones químicas disminuyendo la energía de activación (diferencia entre la energía libre del estado de transición y la del sustrato). El sustrato tras su unión a la enzima, puede evolucionar hasta el producto por un camino energético más favorable. Las enzimas no modifican la naturaleza del producto final de la reacción. 
• El centro activo: Se trata de una zona bien delimitada de la proteína enzimática, capaz de unirse al sustrato formando un complejo enzima – sustrato y de catalizar su transformación. Es, por tanto, el responsable de la especificidad y de la actividad catalítica de la enzima.
• Coenzimas y cofactores: Muchas enzimas son proteínas conjugadas y contienen algún componente de naturaleza no proteica, que se denomina cofactor (iones metálicos en las metaloenzimas, moléculas orgánicas en las coenzimas). El cofactor suele ser esencial para la catálisis enzimática, y junto a la parte proteica de la enzima o apoenzima, constituye la holoenzima. 
• Cinética Enzimática: Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción: el complejo enzima-sustrato evolucionará a producto y enzima libre, tanto más rápidamente cuanto mayor sea la capacidad catalítica de la enzima. Muy a menuda la velocidad da reacción varía de forma hiperbólica en función de la concentración de sustrato. 
• Reacción de primer orden: a concentraciones de sustrato bajas, la velocidad de reacción aumenta proporcionalmente con la concentración de éste. 
• Reacción de orden cero: a medida que la concentración de sustrato crece, esta dependencia disminuye, hasta que, a concentraciones elevadas, la velocidad de reacción es prácticamente constante, tendiendo asintóticamente a un valor de velocidad máxima. 

Ecuación de Michaelis y Menten 

Esta ecuación corresponde a una hipérbola rectangular y da cuenta de la relación entre la concentración de sustrato y velocidad de reacción. K tiene unidades de concentración, además cuando V=Vmáx/2, la ecuación se simplifica a (S)=Km. Por tanto la constante Michaelis coincide con la concentración de sustrato para la que se alcanza la mitad de la velocidad máxima. Así a menor valor de Km, la enzima se satura de sustrato a menores concentraciones de éste. La afinidad de una enzima por un sustrato determinado será tanto mayor cuanto menor sea la constante de Michaelis correspondiente.

Representación de los datos cinéticos: Desde 1913 se han desarrollado múltiples maneras de representar gráficamente los datos cinéticos para la ecuación de Michaelis-Menten. Todos los métodos gráficos deben esforzarse por resolver Vmáx lo más precisamente posible, ya que si Vmáx no se conoce con precisión, no se puede determinar Km con rigor. 

Frecuentemente se emplean dos transformaciones lineales de la ecuación. En primer lugar, la representación de Linerweaver – Burk, o representación  de dobles inversos, se obtiene considerando el inverso de la ecuación del estado estacionario de Michaelis – Menten. Los datos cinéticos pueden llevarse a una gráfica de 1/v frente a 1/(s), de forma que la recta obtenida corta al eje de 1/v en 1/Vmáx, y la intersección con el eje 1/(s) es igual a -1/Km. Una segunda forma de la ecuación también utilizada, es la representación de Eadie – Hoftsee. 

Inhibición Enzimática 

Se denominan inhibidores o activadores aquellas moléculas capaces de unirse específicamente a una enzima, disminuyendo o aumentando su actividad, respectivamente. El estudio de estas moléculas tiene un gran interés básico y aplicado. En todos los organismos, la activación o inhibición de algunas enzimas claves en las distintas rutas metabólicas contribuyen a su regulación. Además, la actividad de numerosos fármacos, como muchos antibióticos, se basa en su capacidad de inhibir algunas enzimas. 

Atendiendo al modo de unión a la enzima, los inhibidores se clasifican en dos grupos: irreversibles (se unen a la enzima covalentemente y la inhiben permanentemente) o reversibles (se unen a la enzima mediante enlaces no covalentes), que pueden ser: competitivos, no competitivos o acompetitivos. 

• Inhibidores competitivos: poseen una estructura semejante al sustrato, y son reconocidos por el centro activo de la enzima. Aumenta el Km de la enzima por su sustrato, sin modificar la Vmáx de la reacción. 
• Inhibidores no competitivos: se unen a sitios específicos en la molécula de enzima. Provoca una disminución de la Vmáx, sin alterar el Km. 
• Inhibidores acompetitivos: se unen al complejo enzima – sustrato. El valor de Km es menor y la Vmáx también.

Aplicaciones del Análisis de las Enzimas 

Enzimas Aisladas 

La información más segura acerca de las propiedades catalíticas y reguladoras de las enzimas, solo puede obtenerse tras su purificación. Normalmente, el primer paso es la homogenización del tejido, seguida de otros procedimientos dirigidos a la separación de las proteínas presentes. Se consigue una purificación preliminar precipitando con determinadas concentraciones de sal o con disolventes orgánicos, y se completa con procedimientos cromatográficos más selectivos. A pesar de los datos que se obtienen con las enzimas purificadas, siempre quedan dudas sobre su validez en la célula intacta, donde las condiciones pueden ser muy diferentes, por esta razón se ha optado en un gran número de estudios con enzimas, trabajar con éstas sin purificar. 

Aplicación Clínica de las Isoenzimas

Los Isoenzimas o isozimas son enzimas que catalizan la misma reacción pero que se desplazan de forma diferente en la electroforesis.  Sus propiedades físicas también pueden ser diferentes.  Su mecanismo más común de formación supone el ordenamiento de subunidades provenientes de dos locigenéticos diferentes en distintas combinaciones para formar el enzima polimérico activo.  Los estudiados para aplicaciones clínicas son el lactato deshidrogenasa, la creatina quinasa y la fosfatasa alcalina. 

Aspectos Médicos en la Enzimología

Aunque la enzimología y la termodinámica, parezca tener poco que ver con el trabajo habitual del médico, el conocimiento de las enzimas y de sus propiedades puede contribuir a la buena práctica clínica. 

1. Las enzimas como Elemento de Diagnóstico

La diferencia de las actividades enzimáticas entre personas normales y pacientes constituye un valioso medio de diagnóstico en un gran número de situaciones. 

a. Procedencia de la Enzima 

Dependerá del estado en que se sospeche que está y de la localización habitual de la enzima.  Los líquidos corporales, como sangre o plasma, linfa, líquido cerebroespinal, amniótico u orina, son relativamente fáciles de muestrear, al igual que las heces, sin embargo en casos particulares se hace necesario medir la actividad de la enzima en un tejido (normalmente, mediante biopsia con aguja). 

b. Diagnóstico Diferencial 

Un problema que se presenta a la hora de hacer el diagnóstico es que los síntomas que presenta el paciente pueden ser causados por patologías previas.  Como no todos los tejidos tienen la misma dotación de enzimas, son importantes para el diagnóstico aquellas enzimas específicas para determinado tejido y mediante la medida de las actividades enzimáticas en plasma, se puede identificar el tejido lesionado, lo cual es de gran valor para dar un diagnóstico definitivo. 

c. Terapia de Monitorización 

La lesión de un tejido conduce a permeabilización de la membrana y mayor pérdida de ciertas enzimas, por ello la mejoría de un paciente debe ir acompañado por la disminución de la actividad enzimática en el torrente sanguíneo.  Esto es importante para estimar la efectividad de la terapia aplicada y la dosis de agentes administrados al paciente. 

d. Diagnóstico de los Errores Congénitos del Metabolismo 

La actividad enzimática anormalmente baja en alguno de uno o más tejidos produce un tipo de enfermedades conocidas por «errores congénitos de metabolismo». 

Como la enfermedad es causada por deficiencia en determinada enzima se debe encontrar la baja actividad de la enzima en una muestra. 

e. Factores que Inciden en la Utilización para el Diagnóstico para los Datos sobre Actividad Enzimática 

Si el diagnóstico depende del valor de una enzima en un determinado líquido corporal o tejido, es necesario que esta alteración sea causada por la patología y no por la preparación de la muestra, por lo que se hace necesario que se tomen las precauciones necesarias y además tener en cuenta los efectos de la actividad enzimática, del método de toma de muestras, del almacenamiento de las muestras, la temperatura y el PH, como el efecto de los posibles activadores e inhibidores y la presencia de drogas.  Además la actividad normal de una enzima puede variar dependiendo de la edad, sexo y raza del paciente. 

2. Las Enzimas como Reactivos de Laboratorios 

Muchas enfermedades metabólicas se caracterizan por variaciones en las concentraciones de ciertos metabolismos o en otros líquidos corporales. 

Para algunos ensayos las enzimas pueden emplearse como reactivos.  Los ensayos enzimáticos permiten la determinación específica y exacta de la concentración de metabolitos individuales en los líquidos corporales sin necesidad de purificarlos. 

3. Las Enzimas y la Sensibilidad a las Drogas 

Muchas drogas son metabolizadas en los tejidos del organismo (particularmente el hígado) mediante reacciones catalizadas por enzimas. Generalmente, la metabolización de la droga reduce su efectividad, lo que se tiene en cuenta a la hora de recomendar la dosis. Sin embargo, si determinado paciente presenta una actividad de las enzimas que metabolizan la droga baja, el efecto de la droga será más intenso y se mantendrá durante un periodo mucho más prolongado, lo cual puede amenazar la vida del paciente. 

4. Las Enzimas y los Venenos 

Los venenos pueden dañar la salud e incluso provocar la muerte por inhibición de una o más enzimas importantes del metabolismo. 

Significado Clínico de la Fosfatasa Alcalina 

La fosfatasa alcalina es una hidrolasa con muy poca especificidad de sustrato. Se encuentra presente en casi todos los tejidos del cuerpo, especialmente, en epitelio intestinal, túbulos renales, hueso, hígado y placenta. Su localización celular es la membrana. Los individuos de los grupos sanguíneos B o O secretores tienen la isoenzima intestinal en sus sueros. 

La fracción hepática es termoestable, en cambio, la fracción que proviene del hueso, sistema retículo-endotelial y vesicular, es termolábil. Las cinco isoenzimas se diferencian por su estructura molecular, propiedades fisicoquímicas, antigénicas y catalíticas. Aparte de estas formas moleculares, la fosfatasa alcalina puede presentar algunas formas atípicas: fracción biliar (fracción hepática rápida o alfa rápida); formas de origen neoplásico (isoformas Regan, Nagao y Kasahara) y formas de migración lenta (complejos moleculares de gran tamaño constituidos por la enzima y una molécula de IgG). 

La actividad sérica de fosfatasa alcalina ósea en condiciones normales, alcanza su mayor actividad en los niños en edad de crecimiento (llegando a triplicar los niveles del adulto) debido a que esta isoenzima se localiza en los osteoblastos (relacionados con la calcificación y formación de estructuras óseas). También es fisiológico el aumento que se produce al final del primer trimestre del embarazo, a expensas de la isoenzima placentaria, que en este período alcanza niveles máximos (aproximadamente el doble de los valores normales). 

• Utilidad clínica: Tiene dos aplicaciones clínicas muy útiles: en enfermedad obstructiva hepática y en enfermedad metabólica ósea, asociada a incremento de la actividad osteoblástica. 
• Variables por enfermedad: Aumentado: Enfermedades renales (raquitismo renal), enfermedades metabólicas óseas (fracturas en vía curativa), enfermedades óseas (carcinoma metastásico óseo, sarcoma, mieloma, enfermedad de Paget), enfermedades hepáticas (obstrucción biliar, colangitis, cirrosis portal), septicemia, colitis ulcerosa, tirotoxicosis, hiperparatiroidismo, malabsorción (déficit de vitamina D), infarto agudo de miocardio, infarto pulmonar, infarto renal. 
• Disminuido: Hipotiroidismo, escorbuto, cretinismo, acondroplasia. 
• Variables por drogas: Aumentado: Acetaminofén, cefotoxina, fluoresceína, sales de magnesio, sales de manganeso, allopurinol, ácido aminosalicílico, andrógenos, anticonvulsivantes, barbituratos, bromocriptina, captotril, carbamacepina, cefalosporina, ciclosporina, eritromicina, gentamicina, tetraciclina. 
• Disminuido: Anticonceptivos orales, 17-b -estradiol, etinilestradiol, fluspirileno, prednisona, b -propiolactona, tamoxifeno. 
• Variables preanalíticas Aumentado: Bilirrubina, hemoglobina, albúmina, uremia. Crecimiento. Menopausia, embarazo. Obesidad. Ambulación, ejercicio. Heroína. Hemólisis. Disminuido: Tratamiento con calor de la muestra. Trauma. 

Objetivos 

General 

Comprender los parámetros cinéticos de la enzima fosfatasa alcalina con respecto a su reacción con su sustrato (para nitrofenil fosfato). 

Específicos

• Reconocer la utilidad que posee el estudio y análisis de las enzimas para aplicaciones clínicas, como el diagnóstico de enfermedades. 
• Conocer y adquirir experiencia en el manejo de los instrumentos necesarios para la práctica de espectrofotometría. 
• Determinar las ecuaciones que nos permitirán realizar los cálculos para hallar las concentraciones. 
• Determinar el Km de la enzima fosfatasa alcalina bajo el efecto de la variación de sustrato. 
• Identificar el tipo de inhibición efectuada por el fosfato inorgánico sobre la actividad catalítica que presenta la enzima. 
• Analizar comparando los resultados en la interpolación de las gráficas del Km y Ki 
• Conocer las posibilidades que tenemos con la espectrofotometría, como medio de diagnosis clínica o identificación de una patología.