Métodos Para la Extracción de ADN en Laboratorio

Procedimiento y Análisis

El proceso efectuado en el laboratorio para la purificación del DNA a partir de leucocitos humanos, se basó en la aplicación del método «Wizard Genomic Purification Kit» como ya lo habíamos mencionado anteriormente. 

1. Partiendo de una muestra de 300 ml de sangre humana (sacada con una micropipeta graduada previamente y limpiada luego con fluhidróxido de sodio para aumentar el ph y destruir la contaminación biológica que probablemente adquirió) previamente tratada con heparina que es un anticoagulante, se procedió a mezclar con el tampón de cloruro de magnesio (Cell Lysis Solution y el cual tenía una cantidad de 900 ml) que entra en las células y genera una desestabilización osmótica, haciendo que las células se hinchen y se estallen sus membranas celulares. Todo esto se logra en un tiempo de incubación de 10 minutos a 37ºc para favorecer la reacción. Luego procedemos a centrifugar para ayudar con el rompimiento de la membrana y a la vez para sedimentar los núcleos de leucocitos, quedando un sobrenadante compuesto por restos de membrana, organelas celulares, protoplasma y restos de hemoglobina que le da un color rojo con tendencia a oscuro. 
2. Se procedió a la extracción del sobrenadante con la micropipeta varias veces para sacar la mayor cantidad posible, evitando succionar los núcleos de los leucocitos. Esta cantidad de núcleos sedimentados es llevada al vórtex por 15 segundos para resuspenderlos y facilitar el mismo proceso. 
3. Se agregaron 300ml de Nuclei Lysis Solution la cual es básica (NONIDET P4O) que actúa selectivamente en la membrana nuclear con el objetivo de romperla y liberar los ácidos nucleicos ejerciendo así su función detergente. Luego de mezclar la solución con la pipeta, se empezó a observar de consistencia muy viscosa. 
4. Adicionamos 1,5 ml de RNase solution y mezclamos invirtiendo el tubo 25 veces para luego proceder a incubar la muestra a 37ºc y por un tiempo de 15 minutos. Este procedimiento se hace con el fin de desintegrar el RNA, quedando así el DNA y varios tipos de proteínas. 
5. Pasados los 15 minutos de incubación agregamos 100ml de Protein precipitation solution (proteinasa K) y colocamos en el vórtex por 20 segundos. La solución de precipitación de proteína que es básicamente cloruro de sodio, solvata las proteínas e inicia su precipitación. Centrifugamos por 3 minutos para agilizar este proceso de precipitación. 
6. Terminado el proceso de centrifugación, se pudo observar una pequeña porción sedimentada de color rojo oscuro que contiene las proteínas y con ellas la presencia de hemoglobina con su color rojo característico. El sobrenadante es de color transparente y contiene el DNA, aunque aún no visible. 
7. Retiramos el sobrenadante y lo mezclamos con 300ml de isopropanol. Luego de haber invertido esta varias veces, buscando la buena interacción de los componentes, pudimos observar el DNA como unas pequeñas fibras de algodón color blanco y esto se logró gracias a que el isopropanol deshidrata el DNA e inicia su sedimentación. 
8. Centrifugamos para sedimentar el DNA y sacar la mayor parte posible de isopropanol y le agregamos al DNA sedimentado 300ml de etanol al 70% para rehidratarlo y luego centrifugar por 1 minuto para sedimentar el DNA ya hidratado. 
9. Aspiramos cuidadosamente el etanol con la pipeta, e invirtiendo el tubo sobre una servilleta se puede sacar el exceso de etanol quedando el DNA en el tubo. Teniendo así el DNA se debe posteriormente dejar al aire 15 minutos y para conservarlo se agregan 100ml de DNA Rehydration solution e incubar a 65ºc/1 hora y luego incubar la solución a 4ºc 

Aplicaciones Clínicas

1. Test de paternidad 

La muestra biológica (sangre, uñas, hisopados o cualquier otro tejido que contenga células humanas con núcleo) se somete a la acción de detergentes, que disuelven los lípidos; y enzimas proteolíticas, que cortan las proteínas, es decir, se está utilizando un kit cualquiera para este procedimiento. 

Luego de incubar la mezcla una noche a 60 grados centígrados, se produce la ruptura de la estructura celular liberando todo su contenido a la solución. 

La mezcla se limpia mediante sucesivos lavados con solventes orgánicos (fenol, cloroformo), que coagulan proteínas y extraen los lípidos, y finalmente el ADN se separa por precipitación con alcohol en medio salino. 

Eventualmente, en los casos de manchas antiguas o huesos, se realizan purificaciones posteriores por diálisis o adsorción a soportes sólidos. 

Existen métodos alternativos en los cuales la muestra sanguínea se deposita sobre un papel especial, que la mantiene inalterada por años a temperatura ambiente. Previo al análisis, se cortan con un sacabocados pequeños fragmentos del papel (alrededor de 1 mm.) y se extraen las impurezas mediante lavados. El papel así procesado, con el ADN adherido, se analiza directamente colocándolo en la mezcla de amplificación. 

Analizando el DNA existen dos metodologías diferentes: 

a) Corte con enzimas de restricción, corrimiento electroforético en geles de agarosa, transferencia a una membrana de nylon o celulosa y tratamiento con sondas de locus múltiple o de locus específico. Estas técnicas han caído en desuso, por lo cual no serán tratadas aquí. De todos modos, si desea información sobre el tema, puede consultar la «Tesis Doctoral», al final del presente resumen. 

b) Amplificación mediante PCR o reacción en cadena de la polimerasa: es un proceso que consiste en imitar una actividad normal de la célula: la copia de ADN, aunque en este caso limitado a pequeños fragmentos, en los cuales están ubicadas las regiones variables. 

Para ello, se coloca en cada tubo una porción del ADN extraído de cada persona y una mezcla que contiene nucleótidos, sales, una enzima que «copia» ADN (denominada polimerasa) y los «primers» que reconocen la zona variable. 

La mezcla se somete a variaciones de temperatura en un ciclador térmico, que produce sucesivamente tres temperaturas diferentes: una que desnaturaliza o separa las cadenas del ADN, otra que facilita que los «primers» reconozcan y se adhieran a la región a copiar, y la tercera que permite la extensión de la cadena copiada, mediante la unión de los nucleótidos que se encuentran en la solución, con la ayuda de la polimerasa. 

Luego, los amplificados se someten a un campo eléctrico en el interior de un soporte semisólido o gel (electroforesis). Como el ADN está cargado negativamente, se dirige hacia el polo positivo, los fragmentos pequeños más rápido que los grandes, produciendo su separación. 

Finalmente, los fragmentos separados se visualizan mediante diferentes métodos: 

• Radiactivos: si uno de los nucleótidos estaba marcado radiactivamente, basta poner el gel en contacto con una película radiográfica, que se revela para observar las variantes. 
• Tinción con plata: se trata el gel con sales de plata, que por su carga positiva son atraídas por la carga negativa de los fragmentos de ADN, y se revela de modo similar a una fotografía. 

Tanto los métodos radiactivos como los de tinción con plata están cayendo en desuso, y en la actualidad son empleados solamente por laboratorios que poseen un escaso volumen de trabajo. 

• Sistemas automatizados: son los de última generación, en los cuales al proceso de electroforesis lo efectúa un secuenciador automático, que lee mediante un rayo láser los «primers», marcados con un fluorocromo, adheridos a las zonas variables. Una computadora permite determinar qué variantes son las que se encuentran en cada muestra. 

2. Extracción del DNA del parásito que produce la enfermedad de chagas

Usando el método Extracción de DNA de sangre periférica con Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB), se dejó listo el DNA para ser analizado mediante el método de amplificación PCR, en el siguiente caso: 

La Enfermedad de Chagas es la infección de mamíferos y de triatomineos, producida por un protozoo flagelado, el Trypanosoma cruzi, protozoo mastigóforo que pertenece a la familia Trypanosomatidae, en cuyo ciclo biológico intervienen mamíferos y un insecto vector. Los huéspedes mamíferos pueden ser el hombre y algunos animales domésticos o silvestres. Este parásito se presenta bajo tres aspectos morfológicos fundamentales: Tripomastigoto, Epimastigoto y Amastigoto. 

Esta enfermedad se puede diferenciar en tres etapas: período agudo, período latente o indeterminado y período crónico. 

La metodología de PCR (Polymerase Chain Reaction), permitirá realizar la extracción del DNA del parásito para su posterior correlación con los resultados obtenidos en individuos chagásicos mediante las técnicas convencionales de serología y xenodiagnóstico, a fin de poder evaluar la efectividad del tratamiento, ya que la respuesta humoral contra los antígenos de Trypanosoma cruzi puede permanecer a través de los años, aunque el parásito no sea demostrable por xenodiagnóstico o cultivo (Brito y cols. 1995); es decir que si se realiza un estudio serológico es este momento, seguramente dará un resultado positivo, por la denominada «cicatriz serológica», a diferencia de la PCR que permite realizar una detección directa del DNA del parásito, indicando efectivamente su presencia y actividad. Por esta razón, la PCR podría en un futuro reemplazar el xenodiagnóstico para la evaluación de la parasitemia en pacientes chagásicos tanto agudos como crónicos. 

Los porcentajes de sensibilidad de la PCR varían de 96% al 100%, como se puede observar, siempre son mayores que los obtenidos con los exámenes de xenodiagnóstico, los cuales tienen una sensibilidad de aproximadamente 50%. 

Conclusión

El método utilizado para la extracción de DNA, permite purificar en un grado relativamente alto (porque depende con la precisión de la toma de muestras y de procedimiento su éxito) y pudimos determinar que es factible utilizarlo en posteriores ocasiones ya que es muy fácil de utilizar y se presta para varias aplicaciones clínicas.