Como extraer ADN es de gran utilidad en muchas aplicaciones de la medicina. Ya que la medicina del futuro es la genética, y el estudio de la genética comienza analizando el genoma, es importante conocer diferentes métodos que nos permitan extraerlo para poderlo analizar.
Es objetivo de este informe:
- Denotar los diferentes métodos disponibles para la extracción del DNA.
- Ejemplificar un método que permitirá conocer como es que funciona la técnica en este tipo de procedimientos.
- Aprender la metodología utilizada para la extracción del DNA.
- Profundizar en la teoría para conocer algunos aspectos de aplicaciones clínicas y saber qué técnicas nos ofrecen mejor rendimiento.
- Obtener DNA con un máximo grado de pureza, basado en la buena aplicación del método.
Marco Teórico
La molécula de ADN (que es la que se va a extraer en este laboratorio) está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Las dos cadenas de nucleótidos que constituyen una molécula de ADN, se mantienen unidas entre sí porque se forman enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan enfrentadas.
La unión de las bases se realiza mediante puentes de hidrógeno, y este apareamiento está condicionado químicamente de forma que la adenina (A) sólo se puede unir con la Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C).
La estructura de un determinado ADN está definida por la «secuencia» de las bases nitrogenadas en la cadena de nucleótidos, residiendo precisamente en esta secuencia de bases la información genética del ADN. El orden en el que aparecen las cuatro bases a lo largo de una cadena en el ADN es, por tanto, crítico para la célula, ya que este orden es el que constituye las instrucciones del programa genético de los organismos.
Conocer esta secuencia de bases, es decir, secuenciar un ADN equivale a descifrar su mensaje genético.
La estructura en doble hélice del ADN, con el apareamiento de bases limitado ( A-T; G-C ), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita automáticamente el orden de la otra, por eso se dice que las cadenas son complementarias. Una vez conocida la secuencia de las bases de una cadena, se deduce inmediatamente la secuencia de bases de la complementaria.
Replicación del ADN
Es la capacidad que tiene el ADN de hacer copias o réplicas de su molécula. Este proceso es fundamental para la transferencia de la información genética de generación en generación.
Las moléculas se replican de un modo semiconservativo. La doble hélice se separa y cada una de las cadenas sirve de molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. El resultado final son dos moléculas idénticas a la original.
Existen varios métodos para la purificación del ADN. Por ejemplo, con la extracción directamente de 300 ml. de sangre completa se puede utilizar el Kit comercial «Wizard genomic DNA purification kit» que sirve para purificar material genético de humanos, células en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias. Para la realización de este y otros métodos se debe seguir las instrucciones del fabricante, (esta técnica es la que vamos a utilizar en este laboratorio para purificar DNA, y se describirá posteriormente sus pasos para la obtención de dicho material). Con esta técnica, podemos utilizar posteriormente los análisis de DNA tales como amplificación (PCR), digestión con endonucleasas de restricción, southern blot o Dot blot.
Otros métodos son:
- Método comercial InstaGene Matrix: donde también se extrae DNA a partir de sangre entera, diseñado para aislar DNA que posteriormente será utilizado en reacciones de PCR. En un tubo Eppendorf se agrega solución de Lysis Buffer (pH: 7.9) y sangre entera. Luego de varios lavados y centrifugaciones con este buffer, se descarta el sobrenadante y se agrega el InstaGene Matriz al pellet obtenido. Por último, se realizan dos incubaciones, una a 70ºC y otra a 95ºC. Las muestras son guardadas a -20ºC hasta la realización de la técnica de PCR, digestión con endonucleasas de restricción, southern blot o Dot blot.
- Método Salting Out: En este método se utiliza un buffer que contiene Proteinasa K ( Tris-HCl, pH 8.3,Tween 20, Nonidet P40, Proteinasa K), la cual destruye las membranas nucleares, liberando a la solución los ácidos nucleicos. El paso siguiente consiste en la precipitación de los ácidos nucleicos, ya que el DNA presente en soluciones con alta concentración de sales acetato de sodio (AcONa) puede precipitarse mediante la adición de alcohol etílico a dichas soluciones.
- Extracción de DNA de sangre periférica con Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB): El fundamento es similar al método anterior, pero en este caso no se utiliza el buffer con Proteinasa K y, la liberación de los ácidos nucleicos se realiza con una solución de homogeinización (CTAB, NaCl, b-mercaptoetanol, EDTA, Tris-HCl pH 7.5). El CTAB es una sal de amonio cuaternario, uno de cuyos grupos alquilo es de gran magnitud molecular, y tiene propiedades detergentes; se conocen con el nombre de jabones invertidos, debido a que su actividad superficial se debe a la presencia de un ion positivo y no a uno negativo, como sucede en los sulfatos de alquilo e hidrógeno, que son los detergentes usuales. Luego se realizó la extracción de los ácidos nucleicos con cloroformo: alcohol isoamílico, y la posterior precipitación del DNA con etanol absoluto primero, y posteriormente con etanol 70%. Esta es considerada por muchos la una técnica que reúne los requisitos fundamentales para purificación del DNA, ya que sirve para amplificación PCR, mostrando una pureza muy alta del material que separa.
La purificación del DNA es importante porque permite:
- Identificar mutaciones.
- Ver características propias de los tipos de DNA (Polimorfismo).
- Para clonar (Genes específicos, fragmentos de cromosomas o individuos).
- Aislar DNA afectado y compararlo con uno bueno.
- Detectar en las muestras, la presencia de un largo espectro de agentes patogénicos.
- Identificar resistencia microbiana.
- Evaluar desordenes genéticos, neurodegenerativos, neoplásicos, imunológicos.
- Medicina forense para la identificación de personas.
- Para hacer tests de paternidad.
Hay que tener en cuenta que es muy importante la fuente de células de las cuales voy a extraer el DNA , ya que de esto depende la facilidad para la ejecución del procedimiento, Por ejemplo la extracción del DNA de las células del cabello es difícil de separar su DNA pero es muy fácil conseguir el pelo, o la extracción de DNA de leucocitos es fácil pero para conseguirlos es más dificultoso.
Imagen tomada de www.todamateria.com
Conceptos Importantes
Heparina: Heteropolisacárido complejo; posee buena cantidad de grupos sulfato y residuos glucosalina. La heparina inhibe la coagulación de la sangre por activación de la antitrombina III. En cantidades pequeñas la heparina no tiene un efecto significativo en muchas de las determinaciones de laboratorio y se utiliza generalmente como anticoagulante en las muestras de sangre en los laboratorios clínicos. El citrato, la heparina y el EDTA entre otros, son anticoagulantes que imposibilitan la disponibilidad de iones de calcio, que es imprescindible en la coagulación, y ya sin el calcio, la muestra de sangre al centrifugarla no se coagulará y se podrán separar las moléculas sin problema.
Isopropanol: (CH3 CHOHCH3). Líquido transparente, volátil e incoloro empleado en el laboratorio químico para extraer y disolver lípidos y en histología se usa como solubilizante de los colorantes de grasas y como agente deshidratante. El isopropanol precipita el DNA porque compite con este por el agua, deshidratándolo y llevándolo al fondo del tubo.
Etanol: (CH3CH2OH). Líquido volátil, incoloro, miscible con agua, metanol, éter, acetona y cloroformo. Se emplea principalmente como solvente en muchosprocedimientos de laboratorio, como agente deshidratante en histología como solvente de algunas sustancias 8tinturas) y como desinfectante.
Solvatación: Interacción estabilizadora de un solvente con un soluto o de un solvente con grupos funcionales en la superficie de un material insoluble.
Materiales y Reactivos
- Tubos vacutainer con EDTA, heparina o citrato
- Tubos eppendorf estériles de 1.5 ml
- Micropipetas
- Puntas
- Vortex
- Microcentrífuga para viales de 1.5 ml
- Guantes
- Agua deionizada grado I (MQ) estéril (H2Odd)
- Baño de agua a 37°C
- Isopropanol
- Etanol 70 %
Metodología
- 900 µl de Cell Lysis Solution en tubo eppendorf de 1.5 ml.
- Transferir 300 µl de sangre venosa periférica anticoagulada mezclar por inversión 5 veces.
- Incubar 10 minutos e invertir tubo 3 veces para lisar los eritrocitos
- Centrifugar a 16.000 x g/1 minuto/temperatura ambiente.
- Remover sobrenadante, sin resuspender el botón de leucocitos.
- Colocar tubo en vortex fuerte 15 segundos hasta resuspender completamente los leucocitos
- Adicionar 300 µl de Nuclei Lysis Solution y resuspender 6 veces con pipeta
- Adicionar 1.5 µl de RNase Solution, mezclar, invertir 25 veces e incubar a 37°C/15 minutos.
- Adicionar 100 µl de Protein Precipitation Solution y colocar en vortex fuerte por 20 segundos
- Centrifugar a 16.000 x g/3 minutos/temperatura ambiente.
- Transferir sobrenadante a tubo eppendorf de 1.5 ml nuevo, que tiene 300 µl de isopropanol.
- Mezclar por inversión hasta que el DNA se haga visible
- Centrifugar a 16.000 x g/1 minuto/temperatura ambiente.
- Remover el sobrenadante y adicionar 300 µl de etanol al 70% a temperatura ambiente. Invertir el tubo varias veces para lavar el botón con el DNA.
- Centrifugar a 16.000 x g/1 minuto/temperatura ambiente
- Aspirar cuidadosamente el etanol con una pipeta Pasteur o con puntas para secuenciamiento. En este punto se puede perder muy fácilmente el DNA.
- Invertir el tubo sobre una servilleta y deje secar al aire por 15 minutos.
